Roche BenchMark ULTRA Interpretation Guide

Marka: Roche

Model: BenchMark ULTRA

Typ: Interpretation Guide

Niniejsza instrukcja jest również odpowiednia dla

BenchMark XT/LT

Podręcznik interpretacji wyników uzyskanych

za pomocą panelu VENTANA MMR RxDx

Panel przeznaczonego do oceny tkanek raka

trzonu macicy (endometrial carcinoma, EC)

VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse Monoclonal Primary Antibody

VENTANA anti-PMS2 (A16-4) Mouse Monoclonal Primary Antibody

VENTANA anti-MSH2 (G219-1129) Mouse Monoclonal Primary Antibody

VENTANA anti-MSH6 (SP93) Rabbit Monoclonal Primary Antibody

Spis treści

Wstęp 1

Przeznaczenie 3

Przeznaczenie produktu 3

Przeznaczenie tego podręcznika interpretacji 3

Ocena kliniczna 4

Charakterystyka barwienia 4

Kryteria dopuszczalności morfologii i wybarwienia tła 5

Kryteria, które musi spełniać przypadek przeznaczony do oceny klinicznej 5

Algorytm oceniania 6

Kontrole 8

Wewnętrzne kontrole dodatnie 8

Postępowanie z materiałem badanym 10

Zdjęcia referencyjne 12

Przypadki wskazujące na prawidłowe działanie systemu MMR 12

Przypadki wskazujące na upośledzenie działania systemu MMR 14

Trudne przypadki 18

Wpływ warunków przedanalitycznych na działanie panelu VENTANA MMR RxDx Panel 28

Dopuszczalne warunki utrwalania umożliwiające uzyskanie optymalnych wyników barwienia 28

Stabilność preparatów ciętych skrawków tkanek 32

Grubość tkanki 32

Bibliograﬁa 33

Naprawa niesparowanych zasad w DNA (mismatch repair, MMR)

to konserwowany mechanizm molekularny, którego funkcją jest

korygowanie substytucji nieodpowiednich zasad, występujących

spontanicznie podczas replikacji DNA. Wyniki badań wykonywanych

metodami opartymi na łańcuchowej reakcji polimerazy (polymerase

chain reaction, PCR) wskazują, że nieprawidłowe działanie

systemu MMR często prowadzi do niestabilności mikrosatelitarnej

(microsatellite instability, MSI), zaburzenia, które powoduje insercję

krótkich, tandemowych powtórzeń nukleotydów do sekwencji

DNA.– Jeśli odsetek powtórzeń w badanym loci mikrosatelitarnym

wynosi co najmniej 30%, MSI jest określana jako niestabilność

mikrosatelitarna wysokiego stopnia, czyli MSI-High (MSI-H).

Zaburzenia działania systemu MMR powiązano z mutacjami

występującymi w białkach tworzących system MMR, najczęściej

w białkach MLH1, PMS2, MSH2 i MSH6.

W prawidłowym stanie białka MLH1 i PMS2 współdziałają w formie

kompleksu heterodimerycznego, podobnie jak białka MSH2 i MSH6.

Gdy system MMR działa prawidłowo, heterodimer złożony z białek

MSH6/MSH2 przyłącza się do sekwencji DNA, w której obecne są

niesparowane zasady. Wywołuje to zmianę konformacyjną, która

umożliwia związanie kompleksu MSH6/MSH2 z przyłączonym DNA

przez heterodimer MLH1/PMS2, co prowadzi do naprawy DNA

poprzez wycięcie odcinka DNA z niesparowanymi zasadami.

Mutacje lub niedobory tych białek przyczyniają się do częstego

występowania MSI i mutacji somatycznych w wyniku błędów

replikacji. Wykazano, że badania pod kątem systemu MMR metodami

immunohistochemicznymi (immunohistochemistry, IHC) mogą być

przydane do identyﬁkacji genów systemu MMR, w których mogą być

obecne mutacje germinalne lub somatyczne.

Zwykle schematy leczenia pacjentów z rakiem były zdeterminowane

przez specyﬁczny typ złośliwości. Nowe immunoterapie, zwłaszcza te,

które modyﬁkują szlaki komórkowe, w które zaangażowane są białka

takie jak receptor programowanej śmierci 1 (programmed death

1, PD-1) lub ligand programowanej śmierci 1 (programmed death

ligand 1, PD-L1), przyczyniają się jednak do wprowadzania zmian

w strategiach terapeutycznych stosowanych przez lekarzy. Białko

PD-1 to receptor hamujący, ulegający ekspresji w limfocytach T po

ich aktywacji, która utrzymuje się w stanach przewlekłej stymulacji,

takich jak przewlekłe zakażenie lub obecność raka. Ekspresję

białka PD-L1 wyryto w komórkach układu odpornościowego oraz

komórkach nowotworów złośliwych, a nieprawidłowa ekspresja

białka PD-L1 w komórkach nowotworowych (tumor cell, TC)

upośledza odpowiedź odpornościową skierowaną przeciwko

komórkom nowotworowym, awięc utrudnia możliwość ich

eliminacji. Z tego względu przerwanie szlaku PD-L1/PD-1

wydaje się być obiecująca strategią wzmocnienia odpowiedzi

odpornościowej limfocytów T skierowanej przeciwko tym komórkom.

Białka tworzące system MMR (MLH1, PMS2, MSH2 i MSH6)

ulegają ekspresji w proliferujących komórkach prawidłowych

i komórkach nowotworów złośliwych. W wielu powszechnie

występujących rakach stwierdzane jest upośledzenie działania

systemu MMR (MMR deﬁcient, dMMR) oraz obecność MSI.

Liczne badania wskazują, że niedobór białek systemu MMR

jest skorelowany ze wzmożoną ekspresją białek PD-1 lub

PD-L1.– Białka systemu MMR mogą zatem służyć jako

biomarkery predykcyjne wskazujące możliwość wdrożenia

terapii ukierunkowanej na białko PD-1; na zwiększone

prawdopodobieństwo odpowiedzi na terapię tego typu może

wskazywać szczególnie utrata ekspresji co najmniej jednego

białka systemu MMR.– Stosowanie inhibitorów białka

PD-1 może być korzystne w przypadku wielu, powszechnie

występujących raków charakteryzujących się wysoką częstością

występowania upośledzenia działania systemu MMR i/lub

MSI-H, niezależnie od tkanki, z której wywodzi się rak.

Pacjenci, w przypadku których rozważane jest wdrożenie

terapii ukierunkowanej na białko PD-1, odniosą zatem

korzyści ze stosowania towarzyszącego testu diagnostycznego

umożliwiającego identyﬁkację populacji pacjentów, u których

występuje upośledzenie działania systemu MMR.

Rak trzonu macicy (endometrial carcinoma, EC) to jeden z

najczęściej występujących nowotworów złośliwych układu

rozrodczego.

W przypadku tego raka często stwierdzana jest

obecność wielu mutacji genetycznych, w tym MSI.

Sugerowane

jest również, że MSI obecne w rakach trzonu macicy mogą

powodować wzrost ekspresji białka PD-L1 w porównaniu do

raków trzonu macicy o genotypie stabilności mikrosatelitarnej

(microsatellite stability, MSS).

Metody leczenia raka trzonu

macicy różnią się w zależności od stopnia zaawansowania,

histologii oraz stadium choroby,

ocena statusu systemu MMR

raka trzonu macicy może jednak ułatwić prognozowanie oraz

dobór odpowiedniego schematu leczenia.

Pacjenci, w przypadku

których rozważane jest wdrożenie terapii ukierunkowanej

na białko PD-1, odniosą zatem korzyści z zastosowania

towarzyszącego testu diagnostycznego umożliwiającego

identyﬁkację statusu systemu MMR.

Utrata ekspresji któregokolwiek z kluczowych białek systemu

MMR, w tym białka MLH1, PMS2, MSH2 lub MSH6, prowadzi do

upośledzenia działania systemu MMR. Jeśli w guzie obserwowane

jest wybawienie wszystkich czterech markerów białkowych, status

VENTANA MMR IHC wskazuje na prawidłowe działanie systemu

MMR. Jeśli w guzie nie jest obserwowane wybarwienie co

najmniej jednego markera białkowego z panelu VENTANA MMR

RxDx Panel, status VENTANA MMR IHC wskazuje na upośledzenie

działania systemu MMR.

Wstęp

Panel VENTANA MMR RxDx Panel przeznaczony do oceny tkanek raka trzonu macicy 1

2 Panel VENTANA MMR RxDx Panel przeznaczony do oceny tkanek raka trzonu macicy

Przeznaczenie

Przeznaczenie produktu

Szczegółowe informacje dotyczące przeznaczenia tego produktu

oraz powiązane wskazania przedstawiono w odpowiednich

ulotkach dołączonych do opakowania panelu VENTANA MMR

RxDx Panel.

Przeznaczenie tego podręcznika interpre-

tacji

Ten podręcznik opracowano w celu:

• udostępnienia patomorfologom narzędzia ułatwiającego

ocenę kliniczną utrwalonych w formalinie i zatopionych

w paraﬁnie (FFPE) skrawków tkanek guza wybarwionych

przy użyciu panelu VENTANA MMR RxDx Panel zgodnie z

proponowanymi zasadami znakowania przy użyciu produktu;

• udostępnienia obrazów fotograﬁcznych ilustrujących wzory

barwienia, które można otrzymać po wybarwieniu tkanek

nowotworowych przy użyciu panelu VENTANA MMR RxDx

Panel;

• udostępnienia przykładowych obrazów trudnych przypadków

w celu przedstawienia wskazówek dotyczących ich oceny;

• udostępnienia wskazówek dotyczących korzystania z

elementów tkanek prawidłowych, dodatnich względem białek

systemu MMR, które służą jako wewnętrzna kontrola dodatnia

podczas przeprowadzania barwienia przy użyciu panelu

VENTANA MMR RxDx Panel.

Panel VENTANA MMR RxDx Panel przeznaczony do oceny tkanek raka trzonu macicy 3

Status systemu MMR — niezakłócona ekspresja białek lub utrata ekspresji białek: w tych przypadkach raka trzonu

macicy obserwowane jest jednoznaczne wybarwienie jąder komórkowych — dominujący wzór barwienia obserwowany w większości

nowotworowych tkanek ze statusem: niezakłócona ekspresja białka MSH6 (panel po lewej). Brak barwienia jądrowego w

tkankach nowotworowych reprezentuje status: utrata ekspresji białka MSH6 (panel po prawej). Jednoznaczne barwienie jądrowe

w komórkach służących jako kontrola wewnętrzna (tj. limfocytach) w pobliżu żywotnych komórek nowotworowych jest wskaźnikiem

dopuszczalności wewnętrznych kontroli dodatnich.

Charakterystyka barwienia

Ocena kliniczna

Komórki wyznakowane w ramach każdego testu zawartego w panelu

VENTANA MMR RxDx Panel są oceniane pod kątem obecności

lub braku sygnału generowanego przez diaminobenzydynę

(diaminobenzidine, DAB). Białka systemu MMR wybarwione przy

użyciu panelu VENTANA MMR RxDx Panel wykazują jądrowy wzór

barwienia. Utrata ekspresji co najmniej jednego z białek systemu

MMR wykrywanych przez panel VENTANA MMR RxDx Panel jest

obserwowana w jądrach komórek nowotworowych. Status systemu

MMR, czyli niezakłócona ekspresja białek lub utrata ekspresji białek,

jest wyznaczany wyłącznie na podstawie jednoznacznego barwienia

jądrowego w komórkach.

• Status: niezakłócona ekspresja białek charakteryzuje

się występowaniem komórek nowotworowych, w których

obserwowane jest jednoznaczne wybarwienie o intensywności

równej lub większej od intensywności wybarwienia kontroli

wewnętrznych powyżej tła.

• Status: utrata ekspresji białek charakteryzuje się brakiem

wykrywalnych sygnałów. W przypadkach ze stwierdzoną

utratą ekspresji może być obserwowane jasnoszare

odbarwienie jąder komórkowych.

Sygnał może być rozłożony równomiernie i charakteryzować

się jednolitym poziomem intensywności w całej nowotworowej

części guza lub rozłożony nierównomiernie i charakteryzować się

zmiennym poziomem intensywności. Sygnał powinien być łatwo

wykrywalny przy małych powiększeniach, takich jak 2x lub 4x.

Przykładowe zdjęcia różnych typów komórek nowotworowych/

wybarwionych elementów wyznakowanych przy użyciu

panelu VENTANA MMR RxDx Panel przedstawiono w części

Zdjęcia referencyjne tego podręcznika interpretacji. W celu

oceny obecności wybarwienia tła w próbkach testowych oraz

oszacowania wyjściowej intensywności wybarwienia stosuje się

odczynnik do kontroli ujemnej (negative reagent control, NRC)

w postaci przeciwciała dopasowanego do gatunku. Kryteria

dopuszczalności morfologii i wybarwienia tła podano w Tabeli 1.

Kryteria, które musi spełniać przypadek przeznaczony do oceny

statusu systemu MMR tkanek nowotworowych przy użyciu

dowolnego z czterech testów zawartych w panelu VENTANA MMR

RxDx Panel, podano w Tabeli 2.

Brak barwienia jądrowego w

komórkach nowotworowych

Jednoznaczne barwienie jądrowe

w komórkach nowotworowych

Silne barwienie jądrowe

w limfocytach

4 Panel VENTANA MMR RxDx Panel przeznaczony do oceny tkanek raka trzonu macicy

MSH6 10x MSH6 10x

Kryteria dopuszczalności morfologii i wybarwienia tła

Każdy przypadek wybarwiony przy użyciu panelu VENTANA MMR RxDx Panel jest oceniany pod kątem dopuszczalności morfologii

tkanek i wybarwienia tła na podstawie kryteriów opisanych w Tabeli 1.

Kryteria, które musi spełniać przypadek przeznaczony do oceny klinicznej

W Tabeli 2 podsumowano kryteria, które musi spełniać preparat z tkanką nowotworową przeznaczoną do oceny pod kątem statusu

systemu MMR, wybarwiony przy użyciu dowolnego testu zawartego w panelu VENTANA MMR RxDx Panel.

Kryterium Dopuszczalne Niedopuszczalne

Morfologia Istotne do oceny elementy komórkowe

są uwidocznione, co umożliwia kliniczną

interpretację swoistego wybarwienia

Istotne do oceny elementy komórkowe nie

są uwidocznione, co uniemożliwia kliniczną

interpretację swoistego wybarwienia

Tło Intensywność wybarwienia tła nie utrudnia

interpretacji klinicznej swoistego wybarwienia

Intensywność wybarwienia tła utrudnia interpretację

kliniczną swoistego wybarwienia

Tabela 1: Kryteria dopuszczalności morfologii i wybarwienia tła

Interpretacja kliniczna Kryteria dotyczące wzoru barwienia

Kryteria kwaliﬁkujące przypadek do oceny

(wszystkie kryteria muszą być spełnione)

1. Obecność ≥50 żywotnych komórek nowotworowych w barwieniu H&E

2. Dopuszczalne wybarwienie preparatu wybarwionego przeciwciałem

Negative Reagent Control

3. Dopuszczalna morfologia

4. Dopuszczalne wybarwienie tła

5. Jednoznaczne barwienie jądrowe w komórkach służących jako

wewnętrzne kontrole dodatnie

Kryteria dyskwaliﬁkujące przypadek

do oceny (jeśli którekolwiek kryterium

zostanie spełnione dla danego preparatu,

należy powtórzyć barwienie preparatu lub

odrzucić przypadek, odpowiednio do danej

sytuacji)

1. Obecność <50 żywotnych komórek nowotworowych w barwieniu H&E

2. Niedopuszczalne wybarwienie preparatu wybarwionego przeciwciałem

Negative Reagent Control

3. Niedopuszczalna morfologia

4. Niedopuszczalne wybarwienie tła

5. Niejednoznaczne barwienie jądrowe w komórkach służących jako

wewnętrzne kontrole dodatnie

6. Utrata tkanki, brak komórek nowotworowych, artefakty i/lub artefakty

brzegowe uniemożliwiające interpretację

Tabela 2: Kryteria kwaliﬁkujące i dyskwaliﬁkujące przypadek do oceny

Panel VENTANA MMR RxDx Panel przeznaczony do oceny tkanek raka trzonu macicy 5

Panel VENTANA MMR RxDx Panel składa się z czterech

testów: VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse Monoclonal Primary

Antibody, VENTANA anti-PMS2 (A16-4) Mouse Monoclonal

Primary Antibody, VENTANA anti-MSH2 (G219-1129) Mouse

Monoclonal Primary Antibody i VENTANA anti-MSH6 (SP93)

Rabbit Monoclonal Primary Antibody. W celu wybarwienia tkanki

przy użyciu każdego z tych przeciwciał należy wykonać seryjne

skrawki tkanki badanej próbki; dodatkowe seryjne skrawki

tkanki badanej próbki potrzebne są do wybarwienia tkanki

hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz przy użyciu przeciwciała NRC

odpowiadającego gatunkowi odpowiedniego przeciwciała panelu

VENTANA MMR RxDx Panel (Negative Control (Monoclonal)

(mNRC) lub Rabbit Monoclonal Negative Control Ig (rNRC)).

Komórki nowotworowe wybarwione za pomocą panelu VENTANA

MMR RxDx Panel są oceniane pod kątem obecności lub braku

sygnału DAB. Pochodzący z tej samej próbki preparat wybarwiony

przy użyciu przeciwciała NRC służy do oceny nieswoistego

wybarwienia tła oraz stopnia wybarwienia tła, które występuje

ze względu na obecność określonych elementów tkankowych

(patrz zdjęcia przypadków charakterystycznych dla prawidłowego

działania i upośledzenia działania systemu MMR).

Jeśli podczas oceny materiału pacjenta wybarwionego H&E

badacz stwierdzi, że materiał nie nadaje się do wybarwienia przy

użyciu panelu (na przykład obecnych jest mniej niż 50 żywotnych

komórek nowotworowych), konieczne będzie pobranie nowego

materiału.

Barwienie materiału przy użyciu określonego testu MMR

RxDx zawartego w panelu (np. VENTANA anti-MLH1 (M1)

Mouse Monoclonal Primary Antibody) należy powtórzyć przy

użyciu niewybarwionych preparatów, jeśli (1) dla preparatu

wybarwionego przy użyciu przeciwciała NRC odpowiedniego

dla danego testu nie uzyskano dopuszczalnego barwienia lub

(2) preparat wybarwiony przy użyciu określonego testu MMR

RxDx (np. VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse Monoclonal

Primary Antibody) nie kwaliﬁkuje się do oceny. Jeśli interpretacja

któregokolwiek preparatu jest niemożliwa ze względu na brak

wybarwienia komórek służących jako wewnętrzne kontrole

dodatnie, obecność artefaktów, nekrozy, efektów brzegowych,

brak tkanki lub inne przyczyny, preparat nie kwaliﬁkuje się do

oceny. Jeśli wybarwienie kontroli jest dopuszczalne, a preparaty

wybarwione przy użyciu panelu VENTANA MMR RxDx Panel

kwaliﬁkują się do oceny, przeszkolony patomorfolog może

dokonać oceny preparatów w sposób opisany w algorytmie

oceniania.

UWAGA: Zestawy OptiView DAB IHC Detection Kit i OptiView

Ampliﬁcation Kit to jedyne zestawy odczynników detekcyjnych

zalecane do użytku z panelem VENTANA MMR RxDx Panel.

W Tabelach 3 i 4 poniżej omówiono możliwe interpretacje

wybarwienia otrzymanego przy użyciu panelu VENTANA MMR

RxDx Panel pod kątem ekspresji białek i statusu systemu MMR.

Przypadki reprezentatywne omówiono w części Zdjęcia

referencyjne.

Ocena wybarwienia wykonanego przy użyciu panelu VENTANA MMR RxDx Panel:

Algorytm oceniania

Tabela 4: Interpretacja wybarwienia otrzymanego przy użyciu panelu VENTANA MMR RxDx Panel pod kątem statusu

systemu MMR

Prawidłowe działanie systemu MMR Upośledzenie działania systemu MMR

Niezakłócona ekspresja wszystkich czterech białek

(MLH1, PMS2, MSH2 i MSH6) identyﬁkowanych przez

panel

Utrata ekspresji co najmniej jednego z czterech białek (MLH1,

PMS2, MSH2 lub MSH6) identyﬁkowanych przez panel

Tabela 3: Interpretacja wybarwienia otrzymanego przy użyciu panelu VENTANA MMR RxDx Panel pod kątem ekspresji

białek

Niezakłócona ekspresja białek Utrata ekspresji białek

Jednoznaczne barwienie jądrowe w żywotnych

komórkach nowotworowych w obecności

dopuszczalnego wybarwienia wewnętrznych kontroli

dodatnich (np. barwienie jądrowe w limfocytach,

ﬁbroblastach lub prawidłowych komórkach

nabłonkowych w pobliżu guza)

Jednoznaczny brak barwienia jądrowego w żywotnych

komórkach nowotworowych lub niejednoznaczne, ogniskowe,

słabe barwienie jądrowe w komórkach nowotworowych w

obecności dopuszczalnego wybarwienia wewnętrznych kontroli

dodatnich. Barwienie jądrowe o charakterze punktowym jest

uznawane za wybarwienie ujemne

6 Panel VENTANA MMR RxDx Panel przeznaczony do oceny tkanek raka trzonu macicy

Rak trzonu macicy — diagnoza kliniczna: prawidłowe działanie systemu MMR

Status: niezakłócona ekspresja

białka MSH2: silne barwienie jądrowe w

obecności dopuszczalnego wybarwienia