Thermo Fisher Scientific VetMAX BTV NS3 All Genotypes Kit Instrukcja obsługi

Typ
Instrukcja obsługi
Wyłącznie do użytku weterynaryjnego. Wyłącznie do użytku in vitro.
INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA
VetMAX BTV NS3 All Genotypes Kit
Wykrywanie wirusa BT (Bluetongue Virus) metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym z sondą TaqMan
Numer katalogowy BTVNS3
Nr publ. MAN0008229 Wer. B.0
WAŻNE! Produkt zarejestrowany przez francuskie krajowe laboratorium referencyjne Anses Maisons-Alfort. W przypadku
używania tego zestawu do procedur diagnostycznych we Francji obowiązują szczególne wymagania, patrz Załącznik A.
Technologia
Gatunek
Kwas nukleinowy izolowany z matryc
Typ testu
RT-PCR w czasie
rzeczywistym (RNA)
- Duplex
- Endogenna dodatnia
kontrola wewnętrzna (IPC)
Bydło
Małe przeżuwacze (owce, kozy)
Krew (w probówkach z EDTA)
Śledziona lub poroniony płód (śledziona,
wątroba, serce)
Próbki pojedyncze
OSTRZEŻENIE! Należy zapoznać się z kartami charakterystyk substancji niebezpiecznych (SDS) i przestrzegać instrukcji
dotyczących obchodzenia się z substancją. Należy nosić odpowiednią odzież ochronną, okulary i rękawiczki. Karty
charakterystyk substancji niebezpiecznych (SDS) są dostępne pod adresem thermofisher.com/support.
OSTRZEŻENIE! POTENCJALNE ZAGROŻENIE BIOLOGICZNE. Należy zapoznać się z informacjami dotyczącymi
bezpieczeństwa związanego z zagrożeniami biologicznymi na stronie opisywanego produktu pod adresem
thermofisher.com. Należy nosić odpowiednią odzież ochronną, okulary i rękawiczki.
Informacje o produkcie
Opis produktu
Pryszczyca rzekoma (choroba niebieskiego języka) jest niezaraźliwą chorobą zakaźną przenoszoną przez owady występującą u owiec,
wpisaną na listę A Światowej Organizacji Zdrowia Zwierząt. Wywoływana jest ona zakażeniem wirusem choroby niebieskiego języka
(Bluetongue virus, wirus BT, BTV), należącym do rodziny Reoviridae, rodzaju Orbivirus. Do tej pory zidentyfikowano 35 różnych
serotypów wirusa BT.
Wirus BT jest zasadniczo uznawany za niebezpieczny dla owiec: powoduje wysoką zachorowalność powiązaną z dużą śmiertelnością.
Wirus ten zakaża także bydło, kozy i dziko żyjące przeżuwacze, ale w przypadku tych gatunków rzadko wywołuje objawy kliniczne
(Lefèvre i Desoutter, 1998).
Wirus przenosi się prawie wyłącznie przez ukąszenie niewielkiego owada krwiopijnego z rodziny Ceratopogonidae, rodzaju
Culicoides. Występuje ponad 1400 gatunków owadów z rodzaju Culicoides, ale nie wszystkie mogą przenosić wirusa. Owad z rodzaju
Culicoides zaraża się poprzez krew pobraną z zakażonego zwierzęcia, a następnie wirus namnaża się do momentu osiągnięcia
wystarczająco wysokiego miana, umożliwiając przeniesienie wirusa na inne podatne zwierzęta.
Zestaw Applied Biosystems VetMAX BTV NS3 All Genotypes Kit służy do diagnostyki molekularnej wirusa BT. Umożliwia
swoiste wykrywanie od 1 do 27 genotypów wirusa BT przy użyciu reakcji PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Nie
wykrywa on wirusa EHDV (wirus krwotocznej choroby zwierzyny płowej), spokrewnionego z wirusem BT.
Każda próbka RNA jest analizowana w pojedynczym dołku: ten sam dołek jest używany do swoistego wykrywania RNA wirusa BT i
dodatniej kontroli wewnętrznej (IPC). Dodatni wynik kontroli IPC wskazuje jednocześnie na prawidłowe wykonanie procesu izolacji
oraz na brak inhibitorów reakcji PCR w próbce.
Zestaw ten można używać z wirusowym RNA wyizolowanym z krwi pełnej (w probówkach z EDTA), śledziony lub narządów
poronionych zwierząt.
Kompletne protokoły izolacji wirusowego RNA z powyższych matryc są dostępne na życzenie w dziale pomocy technicznej.
We Francji należy przestrzegać dodatkowych wymagań opisanych w Załączniku A.
2 VetMAX BTV NS3 All Genotypes Kit Instrukcja użytkowania
Składniki zestawu i przechowywanie
Zestaw VetMAX BTV NS3 All Genotypes Kit zawiera składniki, których można użyć do wykrywania wirusa BT oraz kontroli IPC.
Po otrzymaniu zestaw należy przechowywać w temperaturze od 30°C do −10°C. Po pierwszym użyciu zestawu należy przestrzegać
zaleceń dotyczących przechowywania każdego ze składników wyszczególnionych w poniższej tabeli:
Składnik Opis Objętość
(100 reakcji)
Przechowywanie
Po otrzymaniu Po pierwszym
3 - Mix BTVNS3
(Zielona probówka)
Mieszanina do reakcji RT-PCR z sondą TaqMan. Zawiera
następujące elementy:
System wykrywania sekwencji docelowej wirusa BT: startery
przedni i wsteczny, a także sonda TaqMan wyznakowana
fluoroforem FAM - NFQ (NFQ = niefluorescencyjny wygaszacz).
System wykrywania kontroli IPC: startery przedni i wsteczny, a
także sonda TaqMan wyznakowana fluoroforem
VIC - TAMRA.
Bufor, odwrotna transkryptaza i enzym do reakcji PCR w czasie
rzeczywistym.
2 × 1 000 µl od
30°C do
10°C
od
30°C do
10°C
4a - EPC BTVNS3
(Brązowa probówka)
Zewnętrzna kontrola dodatnia:
Kontrola dodatnia dla wirusa BT. Wykorzystywany jest w niej już
wyizolowany kwas nukleinowy, który jest poddawany denaturacji, a
następnie amplifikacji podczas reakcji RT-PCR w czasie
rzeczywistym.
2 × 90 µl od
30°C do
10°C
od
30°C do
10°C
UWAGA: Zalecamy przechowywanie mieszaniny 3 Mix BTVNS3 w porcjach (minimalna objętość 50-µl), aby uniknąć wykonywania więcej niż 3 cykli
zamrażania/odmrażania.
Kontrole izolacji i amplifikacji
Zestaw VetMAX BTV NS3 All Genotypes Kit zawiera jedną kontrolę wykorzystywaną do weryfikacji prawidłowego przebiegu
procesu amplifikacji wirusowego RNA:
4a - EPC BTVNS3: kontrola dodatnia dla wirusa BT
Kontrola dodatnia, już wyizolowana, która ulega amplifikacji podczas reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym.
Dodatni wynik mieszczący się w określonym zakresie Ct służy do weryfikacji prawidłowego przebiegu procesu amplifikacji docelowej
sekwencji wirusa BT podczas reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym.
Kontrola prawidłowej izolacji kwasu nukleinowego dla każdej próbki jest weryfikowana poprzez wykrywanie endogennej kontroli
IPC (Wewnętrzna kontrola dodatnia) obecnej w każdej próbce.
Dodatni wynik kontroli IPC dla próbki potwierdza izolację tej próbki, niezależnie od tego, czy próbka jest dodatnia lub ujemna pod
kątem badanego patogenu, eliminując fałszywie ujemne wyniki spowodowane inhibicją reakcji PCR.
W celu zagwarantowania prawidłowej analizy zalecamy uwzględnienie dwóch kontroli ujemnych:
NCS: ujemna kontrola izolacji
Kontrola ta zawiera wodę wolną od DNaz/RNaz lub próbkę, o której wiadomo, że jest wolna od docelowego patogenu, z którą
postępuje się w taki sam sposób (izolacja kwasu nukleinowego i reakcja RT-PCR w czasie rzeczywistym) jak z próbkami.
Ujemny wynik dla wirusa BT i kontroli endogennej IPC potwierdza brak kontaminacji procesu izolacji i reakcji RT-PCR w czasie
rzeczywistym.
NC: ujemna kontrola amplifikacji
Ta kontrola zawiera 20 µl mieszaniny reakcyjnej RT-PCR w czasie rzeczywistym i 5 µl wody wolnej od DNaz/RNaz, która jest
poddawana reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym.
Ujemny wynik dla wirusa BT i kontroli IPC potwierdza brak kontaminacji podczas przygotowania i przebiegu reakcji RT-PCR w czasie
rzeczywistym.
Materiały wymagane, ale niedostarczone
O ile nie wskazano inaczej, wszystkie materiały są dostępne na stronie thermofisher.com.
Regulowane mikropipety (zakres od 1 µl do 1 000 µl) z końcówkami z filtrem, wolne od DNaz/RNaz
Woda wolna od DNaz/RNaz
Bufor TE 1x stężony
Bufor PBS 1x stężony
Blok grzewczy umożliwiający osiągniecie temperatury 95°C
Termocykler do reakcji PCR w czasie rzeczywistym umożliwiający wykrywanie następujących fluoroforów:
FAM (maksymalna emisja: λ515 nm)
VIC (maksymalna emisja: λ554 nm)
Materiały eksploatacyjne kompatybilne z używanym termocyklerem:
Płytki 96-dołkowe do reakcji PCR, paski do PCR (8 lub 12 probówek), mikroprobówki lub kapilary
Odpowiednia folia adhezyjna do płytek lub zatyczki do zamykania probówek
We Francji należy przestrzegać dodatkowych wymagań opisanych w Załączniku A.
VetMAX BTV NS3 All Genotypes Kit Instrukcja użytkowania 3
Etapy analizy
Objętość reakcyjna do analizy RT-PCR w czasie rzeczywistym wynosi 25 µl:
3 - Mix BTVNS3: 20 µl na reakcję
Wyizolowane RNA: 5 µl na reakcję
Izolacja wirusowego RNA
Przed analizą RT-PCR w czasie rzeczywistym należy wyizolować RNA z próbek.
UWAGA: W celu uzyskania informacji na temat metod izolacji, które są opracowane dla zestawu VetMAX BTV NS3 All Genotypes Kit
należy skontaktować się z działem pomocy technicznej.
Denaturacja RNA
1. Dodać RNA, które ma być poddane denaturacji, do dołków płytki lub do probówek paska do PCR. Uwzględnić 10-procentową
nadwyżkę wyizolowanego RNA potrzebnego do wszystkich reakcji, aby zapewnić wystarczającą ilości RNA dostępnego po
denaturacji.
2. Zamknąć dołki lub probówki zawierające RNA.
3. Ogrzewać przez 3 minuty w temperaturze od +92°C do +98°C w termocyklerze lub na bloku grzewczym.
4. Przechowywać zdenaturowane RNA w temperaturze od +2°C do +8°C na kruszonym lodzie lub w statywie chłodzącym do
momentu użycia.
Przygotowanie reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym
1. Przygotować plan analizy w celu rozpipetowania mieszanin i próbek. Jeśli to możliwe, umieścić kontrolę dodatnią (EPC) z dala od
innych próbek.
2. Rozmrozić mieszaninę 3 - Mix BTVNS3 w temperaturze od +2°C do +8°C na lodzie lub w statywie chłodzącym.
3. Wymieszać zawartość probówki 3 - Mix BTVNS3, delikatnie wytrząsając probówkę, a następnie krótko ją odwirować.
4. Dodać 20 µl mieszaniny 3 - Mix BTVNS3 do każdego dołka na płytce PCR, do każdej probówki paska do PCR lub do każdej kapilary.
5. Dodać RNA z próbek i kontroli do roztworu mieszaniny reakcyjnej RT-PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z przedstawionym
poniżej planem analizy:
Rodzaj analizy
Składnik
Objętość próbki
Analizowana próbka
RNA wyizolowane z próbki i zdenaturowane
5 µl
Dodatnia kontrola amplifikacji
Zdenaturowana kontrola 4a - EPC BTVNS3
5 µl
Ujemna kontrola izolacji (NCS)
Wyizolowana i zdenaturowana kontrola NCS
5 µl
Ujemna kontrola amplifikacji (NC)
Woda wolna od DNaz/RNaz
5 µl
6. Zakryć płytkę do reakcji PCR, paski do reakcji PCR lub kapilary folią samoprzylepną lub odpowiednimi zatyczkami.
Amplifikacja podczas reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym
1. Skonfigurować następujące detektory w termocyklerze:
Reporter
Wygaszacz
BTV
FAM
NFQ (niefluorescencyjny wygaszacz)
Kontrola IPC wirusa BT
VIC
TAMRA™(1)
Pasywny barwnik referencyjny: ROX™(1)
(1) Jeśli termocykler umożliwia wykrywanie fluoroforów TAMRA i ROX, należy je ustawić dla analizy RT-PCR w czasie rzeczywistym. W przypadku
pozostałych termocyklerów, brak zdolności do wykrywania tych fluoroforów nie wpływa negatywnie na analizę RT-PCR w czasie rzeczywistym.
2. Skonfigurować detektory wirusa BT i kontroli IPC wirusa BT dla każdego dołka używanego w analizie.
3. Skonfigurować jeden z następujących programów do reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym dla analizy:
Tabela 1 Metoda standardowa (do użytku z próbkami oczyszczonymi przy użyciu standardowego skryptu w urządzeniu KingFisher)
Liczba powtórzeń etapu Temperatura Czas trwania
Etap 1 ×1 45°C 10 minut
Etap 2 ×1 95°C 10 minut
Etap 3 ×40 95°C 15 sekund
60°C(1) 45 sekund
(1) Odczyt danych fluorescencyjnych podczas etapu 60°C45 sekund.
Tabela 2 Metoda ekspresowa (do użytku z próbkami oczyszczonymi przy użyciu ekspresowego skryptu w urządzeniu KingFisher)
Liczba powtórzeń etapu Temperatura Czas trwania
Etap 1
×1 48°C 5 minut
Etap 2 ×1 97°C 5 minut
Etap 3 ×40 97°C 2 sekundy
60°C(1) 35 sekund
(1) Odczyt danych fluorescencyjnych podczas etapu 60°C35 sekund.
We Francji należy przestrzegać dodatkowych wymagań opisanych w Załączniku A.
4 VetMAX BTV NS3 All Genotypes Kit Instrukcja użytkowania
4. Umieścić płytkę PCR, paski do PCR lub kapilary w termocyklerze i uruchomić reakcję RT-PCR w czasie rzeczywistym.
Interpretacja wyników
Analiza danych
W celu przeprowadzenia analizy danych należy postępować zgodnie z zaleceniami producenta termocyklera.
1. Ustalić linie progowe oddzielnie dla każdej sekwencji docelowej.
2. Zinterpretować wyniki na podstawie wartości Ct próbek dla każdego detektora zgodnie z poniższymi zaleceniami.
Kryteria walidacji testu
Test uznaje się za zwalidowany, gdy spełnione zostaną następujące kryteria:
Detektor BT
Detektor IPC BT
Kryteria walidacji testu
EPC BTVNS3 Ct = Ct QC BT dla „4a - EPC BTVNS3” ± 3Ct(1) Ct < 40 lub Ct > 40(2)
Reakcja RT-PCR przebiegła
prawidłowo
NCS Ct >40 Ct >40
Proces izolacji wykonano
prawidłowo
NC Ct >40 Ct >40
Odczynniki do reakcji RT-
PCR zostały zwalidowane
(1) Należy zapoznać się z wartościami wskazanymi dla „EPC” w certyfikacie analizy dla danej serii testu.
(2) Nie należy używać wartości kontroli IPC w kontroli EPC do walidacji testu.
Interpretacja wyników
UWAGA: W przypadku używania tego zestawu do procedur diagnostycznych we Francji obowiązują szczególne wymagania, patrz
Załącznik A.
Dla każdej analizowanej próbki wyniki należy interpretować w przedstawiony poniżej sposób:
Detektor BT
Detektor IPC BT
Interpretacja
C
t
<40
C
t
<40 lub C
t
>40
Wykryto wirus BT
C
t
>40
C
t
<40
Nie wykryto wirusa BT
Ct >40
Ct >40
Wynik nieważny
(1)
(1) Próbka zostanie zwrócona jako nieprawidłowa z powodu ujemnej wartości kontroli IPC.
Wykonywanie ponownych testów próbek z nieprawidłowymi wynikami
W przypadku uzyskania nieważnego wyniku dla próbki zalecamy wykonanie jednej z poniższych procedur w zależności od jakości
eluatu RNA.
W przypadku...
Wykonać następujące czynności...
Eluaty łatwe do pipetowania (o
małej lepkości)
1. Rozcieńczyć eluaty RNA w stosunku 1:5 w buforze 1X TE.
2. Denaturować rozcieńczony RNA przez 3 minuty w temperaturze od 92°C do 98°C.
3. Powtórzyć procedurę RT-PCR w czasie rzeczywistym z użyciem 5 μl zdenaturowanego RNA, a następnie
zinterpretować wyniki we wskazany sposób.
Jeśli w reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym otrzymano dodatni lub ujemny wynik na obecność wirusa
BT przy akceptowalnym wyniku kontroli IPC (Ct IPC < 35), uzyskany wynik jest prawidłowy.
Jeśli wynik reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym pozostaje nieprawidłowy (Ct IPC 35), należy
rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:2 w buforze 1X PBS, a następnie powtórzyć procedurę izolacji kwasów
nukleinowych.
Eluaty trudne do pipetowania (o
dużej lepkości)
1. Rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:2 w buforze 1X PBS.
2. Powtórzyć procedurę izolacji kwasów nukleinowych.
3. Denaturować eluat RNA przez 3 minuty w temperaturze od 92°C do 98°C.
4. Powtórzyć procedurę RT-PCR w czasie rzeczywistym z użyciem 5 μl zdenaturowanego RNA, a następnie
zinterpretować wyniki we wskazany sposób.
Jeśli w reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym otrzymano dodatni lub ujemny wynik na obecność wirusa
BT przy akceptowalnym wyniku kontroli IPC (Ct IPC < 35), uzyskany wynik jest prawidłowy.
Jeśli wynik reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym pozostaje nieprawidłowy (Ct IPC 35), należy powtórzyć
analizę przy użyciu nowej próbki.
Załącznik A Dodatkowe wymagania obowiązujące we Francji
Produkt zarejestrowany przez francuskie krajowe laboratorium referencyjne Anses Maisons-Alfort, do użytku
we Francji. Obowiązują następujące szczególne wymagania:
Kontrole izolacji i amplifikacji
W ramach akredytacji COFRAC zgodnie z normą NF U47-600-1 zaleca się stosowanie wewnętrznego materiału referencyjnego,
nazywanego również „wskaźnikiem” („sentinel”), w każdej serii izolacji w celu walidacji etapów izolacji, oczyszczania i amplifikacji.
Ten wskaźnik należy przygotować zgodnie z opisem w załączniku B normy NF U47-600-1 i należy go przetwarzać w taki sam sposób
jak próbkę lub kontrolę EPC.
Interpretacja wyników
Zgodnie z wymogami francuskiego krajowego laboratorium referencyjnego każda próbka, w przypadku której dla kontroli IPC
uzyskano wartość Ct ≥35 powinna zostać przetestowana ponownie (patrz część „Wykonywanie ponownych testów próbek z
nieprawidłowymi wynikami”).
We Francji należy przestrzegać dodatkowych wymagań opisanych w Załączniku A.
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
29 marca 2022 r.
Dokumentacja i pomoc
Obsługa klienta i pomoc techniczna
Pomoc techniczna: odwiedź stronę
thermofisher.com/askaquestion
Na stronie thermofisher.com/support można znaleźć
najnowsze informacje dotyczące oferowanych usług i pomocy
technicznej, w tym:
Numery telefonów kontaktowych na całym świecie
Pomoc w zakresie zamówień i korzystania z witryny
internetowej
Instrukcje obsługi, podręczniki i protokoły
Certyfikaty analizy
Karty charakterystyk substancji niebezpiecznych (SDS,
znane również pod nazwą MSDS)
UWAGA: Aby uzyskać karty charakterystyk substancji
niebezpiecznych dotyczące odczynników i środków
chemicznych innych producentów, należy
skontaktować się z ich producentem.
Ograniczona gwarancja na produkt
Firma Life Technologies Corporation i/lub jej podmioty
stowarzyszone udzielają gwarancji na produkty, jak opisano w
dokumencie Ogólne warunki sprzedaży firmy Life
Technologies dostępnym w witrynie internetowej firmy Life
Technologies pod adresem
www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-
conditions.html. W razie pytań należy się skontaktować z
firmą Life Technologies pod adresem
thermofisher.com/support.
Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Écureuils | Parc
Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu, Francja
Przetłumaczono z publikacji w języku angielskim o numerze publikacji
MAN0008222, wer. C.0.
Informacje podane w niniejszej instrukcji mogą ulec zmianie bez powiadomienia.
ZRZECZENIE SIĘ ODPOWIEDZIALNOŚCI: W ZAKRESIE DOZWOLONYM PRZEZ
PRAWO FIRMA LIFE TECHNOLOGIES I/LUB JEJ PODMIOTY STOWARZYSZONE
NIE PONOSZĄ ODPOWIEDZIALNOŚCI ZA SZKODY SZCZEGÓLNE, PRZYPADKOWE,
POŚREDNIE, SANKCYJNE, WIELOKROTNE LUB WYNIKOWE ZWIĄZANE Z
NINIEJSZYM DOKUMENTEM LUB WYNIKAJĄCE Z NIEGO, W TYM ZWIĄZANE Z
JEGO ZASTOSOWANIEM.
Historia wersji nr publ. MAN0008222 (Angielski)
Wersja
Data
Opis
C.0 23 lutego
2021 r.
Dodano informacje dotyczące nowego
ekspresowego protokołu termalnego.
Zaktualizowano część „Wykonywanie ponownych
testów próbek z nieprawidłowymi wynikami”.
Zaktualizowano część „Opis produktu”.
Zaktualizowano informacje dotyczące licencji
ograniczającej.
B.0
21 listopada
2017 r.
Dodano Załącznik A, „Dodatkowe wymagania
obowiązujące we Francji”.
A.0 23 czerwca
2017 r.
Zaktualizowano na podstawie aktualnego wzorca
dokumentu z uwzględnieniem powiązanych
aktualizacji gwarancji, znaków towarowych oraz logo.
1,0
21 maja 2013
r.
Stan początkowy względem historii wersji
Ważne informacje dotyczące udzielania licencji: Produkty te mogą być objęte co
najmniej jedną licencją ograniczonego zakresu stosowania. Stosowanie tych
produktów przez użytkownika jest równoznaczne z akceptacją wszystkich
mających zastosowanie warunków licencji ograniczonego zakresu stosowania.
©2022 Thermo Fisher Scientific Inc. Wszelkie prawa zastrzeżone. Wszystkie
znaki towarowe są własnością firmy Thermo Fisher Scientific i spółek od niej
zależnych, o ile nie określono inaczej. TaqMan jest zarejestrowanym znakiem
towarowym firmy Roche, używanym na podstawie zezwolenia i licencji.
  • Page 1 1
  • Page 2 2
  • Page 3 3
  • Page 4 4
  • Page 5 5

Thermo Fisher Scientific VetMAX BTV NS3 All Genotypes Kit Instrukcja obsługi

Typ
Instrukcja obsługi