We Francji należy przestrzegać dodatkowych wymagań opisanych w Załączniku A.
2 VetMAX™ BTV NS3 All Genotypes Kit — Instrukcja użytkowania
Składniki zestawu i przechowywanie
Zestaw VetMAX™ BTV NS3 All Genotypes Kit zawiera składniki, których można użyć do wykrywania wirusa BT oraz kontroli IPC.
Po otrzymaniu zestaw należy przechowywać w temperaturze od −30°C do −10°C. Po pierwszym użyciu zestawu należy przestrzegać
zaleceń dotyczących przechowywania każdego ze składników wyszczególnionych w poniższej tabeli:
Składnik Opis Objętość
(100 reakcji)
Przechowywanie
Po otrzymaniu Po pierwszym
3 - Mix BTVNS3
(Zielona probówka)
Mieszanina do reakcji RT-PCR z sondą TaqMan™. Zawiera
następujące elementy:
• System wykrywania sekwencji docelowej wirusa BT: startery
przedni i wsteczny, a także sonda TaqMan™ wyznakowana
fluoroforem FAM™ - NFQ (NFQ = niefluorescencyjny wygaszacz).
• System wykrywania kontroli IPC: startery przedni i wsteczny, a
także sonda TaqMan™ wyznakowana fluoroforem
VIC™ - TAMRA™.
• Bufor, odwrotna transkryptaza i enzym do reakcji PCR w czasie
2 × 1 000 µl od
30°C do
10°C
od
30°C do
10°C
4a - EPC BTVNS3
(Brązowa probówka)
Zewnętrzna kontrola dodatnia:
Kontrola dodatnia dla wirusa BT. Wykorzystywany jest w niej już
wyizolowany kwas nukleinowy, który jest poddawany denaturacji, a
następnie amplifikacji podczas reakcji RT-PCR w czasie
2 × 90 µl od
30°C do
10°C
od
30°C do
10°C
UWAGA: Zalecamy przechowywanie mieszaniny 3 – Mix BTVNS3 w porcjach (minimalna objętość 50-µl), aby uniknąć wykonywania więcej niż 3 cykli
zamrażania/odmrażania.
Kontrole izolacji i amplifikacji
Zestaw VetMAX™ BTV NS3 All Genotypes Kit zawiera jedną kontrolę wykorzystywaną do weryfikacji prawidłowego przebiegu
procesu amplifikacji wirusowego RNA:
4a - EPC BTVNS3: kontrola dodatnia dla wirusa BT
Kontrola dodatnia, już wyizolowana, która ulega amplifikacji podczas reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym.
Dodatni wynik mieszczący się w określonym zakresie Ct służy do weryfikacji prawidłowego przebiegu procesu amplifikacji docelowej
sekwencji wirusa BT podczas reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym.
Kontrola prawidłowej izolacji kwasu nukleinowego dla każdej próbki jest weryfikowana poprzez wykrywanie endogennej kontroli
IPC (Wewnętrzna kontrola dodatnia) obecnej w każdej próbce.
Dodatni wynik kontroli IPC dla próbki potwierdza izolację tej próbki, niezależnie od tego, czy próbka jest dodatnia lub ujemna pod
kątem badanego patogenu, eliminując fałszywie ujemne wyniki spowodowane inhibicją reakcji PCR.
W celu zagwarantowania prawidłowej analizy zalecamy uwzględnienie dwóch kontroli ujemnych:
NCS: ujemna kontrola izolacji
Kontrola ta zawiera wodę wolną od DNaz/RNaz lub próbkę, o której wiadomo, że jest wolna od docelowego patogenu, z którą
postępuje się w taki sam sposób (izolacja kwasu nukleinowego i reakcja RT-PCR w czasie rzeczywistym) jak z próbkami.
Ujemny wynik dla wirusa BT i kontroli endogennej IPC potwierdza brak kontaminacji procesu izolacji i reakcji RT-PCR w czasie
rzeczywistym.
NC: ujemna kontrola amplifikacji
Ta kontrola zawiera 20 µl mieszaniny reakcyjnej RT-PCR w czasie rzeczywistym i 5 µl wody wolnej od DNaz/RNaz, która jest
poddawana reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym.
Ujemny wynik dla wirusa BT i kontroli IPC potwierdza brak kontaminacji podczas przygotowania i przebiegu reakcji RT-PCR w czasie
rzeczywistym.
Materiały wymagane, ale niedostarczone
O ile nie wskazano inaczej, wszystkie materiały są dostępne na stronie thermofisher.com.
• Regulowane mikropipety (zakres od 1 µl do 1 000 µl) z końcówkami z filtrem, wolne od DNaz/RNaz
• Woda wolna od DNaz/RNaz
• Bufor TE 1x stężony
• Bufor PBS 1x stężony
• Blok grzewczy umożliwiający osiągniecie temperatury 95°C
• Termocykler do reakcji PCR w czasie rzeczywistym umożliwiający wykrywanie następujących fluoroforów:
– FAM™ (maksymalna emisja: λ515 nm)
– VIC™ (maksymalna emisja: λ554 nm)
• Materiały eksploatacyjne kompatybilne z używanym termocyklerem:
– Płytki 96-dołkowe do reakcji PCR, paski do PCR (8 lub 12 probówek), mikroprobówki lub kapilary
– Odpowiednia folia adhezyjna do płytek lub zatyczki do zamykania probówek