Thermo Fisher Scientific VetMAX BVDV 4ALL Kit Instrukcja obsługi

Marka: Thermo Fisher Scientific

Model: VetMAX BVDV 4ALL Kit

Typ: Instrukcja obsługi

Wyłącznie do użytku weterynaryjnego. Wyłącznie do użytku in vitro.

INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA

VetMAX™ BVDV 4ALL Kit

TaqMan® real-time RT-PCR do wykrywania wirusa BVD (typu 1, 2 i 3) oraz wirusa choroby granicznej (typu od 1 do 6)

Numer katalogowy: BVD4ALL

Poz. Nr. MAN0018345 Wer. A.0

Technika Gatunek

Kwasy nukleinowy wyiizolowany

z materiału biologicznego

Rodzaj badania

Real-time RT-PCR (RNA)

• Duplex

• Endogenna lub egzogenna (wyłącznie

w przypadku surowicy) IPC

bydło

owce

kozy

dzikie przeżuwacze

krew

surowica

wycinki z małżowiny usznej

próbki pojedyncze albo zbiorcze

(w zależności od rodzaju próbki i

zastosowanego protokołu

oczyszczania)

OSTRZEŻENIE! Należy zapoznać się z kartami charakterystyk substancji niebezpiecznych (SDS) i przestrzegać wskazówek

dotyczących obchodzenia się z substancją. Należy nosić odpowiednią odzież ochronną, okulary i rękawiczki. Karty

charakterystyk substancji niebezpiecznych (MSDS) są dostępne pod adresem thermofisher.com/support.

OSTRZEŻENIE! POTENCJALNE ZAGROŻENIE BIOLOGICZNE. Należy zapoznać się z informacjami dotyczącymi

bezpieczeństwa związanego z zagrożeniami biologicznymi na stronie opisywanego produktu pod adresem

thermofisher.com. Należy nosić odpowiednią odzież ochronną, okulary i rękawiczki.

Informacje o produkcie

Opis produktu

Zestaw Applied Biosystems™ VetMAX™ BVDV 4ALL Kit jest przeznaczony do wykrywania sekwencji z regionu 5'UTR genomu

(RNA) wirusa BVD (ang. Bovine Viral Diarrhea, wirusowa biegunka bydła) oraz wirusa BD (ang. Border Disease, choroba

graniczna). Jest on przeznaczony do stosowania w przypadku wszystkich przeżuwaczy: bydła, małych przeżuwaczy i dzikich

przeżuwaczy.

Może być stosowany do badania wirusowego RNA wyekstrahowanego z surowicy, pełnej krwi pobranej na EDTA i wycinków z

małżowiny usznej. W przypadku wycinków z małżowiny usznej wirusowe RNA można wyekstrahować metodą szybkiej lizy,

używając zestawu VetMAX™ Ear Notch Fast Lysis Kit (nr kat. FLK). Pełne protokoły ekstrakcji wirusowego RNA z takich

rodzajów materiału biologicznego są dostępne na życzenie w dziale pomocy technicznej. W zależności od zastosowanego

protokołu izolacji wirusowego RNA, a także rodzaju próbki, zestawu VetMAX™ BVDV 4ALL Kit można używać do badania

próbek pojedynczych lub zbiorczych (zgodnie z przepisami prawa krajowego lub lokalnymi rozporządzeniami).

Każdą próbkę RNA uzyskaną po ekstrakcji lub szybkiej lizie bada się w jednej studzience: ta sama studzienka służy również do

specyficznego wykrywania wirusowego RNA wirusa BVD i wirusa BD oraz wykrywania IPC (wewnętrzna kontrola dodatnia).

Dodatnie oznaczenie IPC sygnalizuje skuteczną ekstrakcję i brak inhibitorów PCR w badanej próbce. Cel IPC jest endogenny dla

materiału komórkowego (krew i wycinki z małżowiny usznej). Próbki surowicy wymagają użycia dodatkowej egzogennej IPC

(dołączonej do zestawu) przed ekstrakcją wirusowego RNA.

Składniki zestawu i przechowywanie

Po otrzymaniu cały zestaw należy przechowywać w temperaturze od −30°C do −10°C. Przy pierwszym użyciu zestawu należy

przestrzegać zaleceń dotyczących przechowywania każdego z jego elementów wyszczególnionych w poniższej tabeli:

Składnik Opis

Objętość

(100 25-

µl

reakcji)

Przechowywanie

otrzymaniu

pierwszym

użyciu

3-Mix

BVDV 4ALL

(zielona

probówka)

Mieszanina do TaqMan® RT-PCR. Zawiera:

•system wykrywania celu BVDV: startery sensowne i antysensowne oraz sonda

TaqMan® wyznakowana FAM™ − NFQ (NFQ = wygaszacz niefluorescencyjny),

•system wykrywania IPC: startery sensowne i antysensowne oraz sonda

TaqMan® wyznakowana VIC™ − TAMRA™,

•bufor, odwrotną transkryptazę i enzym PCR.

4 x 500 µl od −30°C do

−10°C

od −30°C do

−10°C

4c-EPC

BVDV 4ALL

(niebieska

probówka)

Zewnętrzna kontrola dodatnia:

Kontrola dodatnia BVDV. To nieaktywny czynnik biologiczny,

przeznaczony do

wyekstrahowania lub lizy,

a następnie do amplifikacji w trakcie reakcji RT-PCR.

150 µl od −30°C do

−10°C

od −30°C do

−10°C

5-IPC

BVDV 4ALL(1)

(żółta

probówka)

Wewnętrzna kontrola dodatnia (dotyczy tylko surowicy):

Egzogenna kontrola wewnętrzna, którą

dodaje się do roztworu lizującego

używanego do ekstrakcji RNA z próbek surowicy oraz do dodatniej i ujemnej

kontroli procesu ekstrakcji.

Może być również stosowana tylko jako kontrola

amplifikacji, jeśli zostanie dodana do wyekstrahowanego RNA.

500 µl od −30°C do

−10°C

od −30°C do

−10°C

(1) Przy małych seriach ekstrakcji zaleca się używać podwielokrotności 5-IPC BVDV 4ALL w minimalnej objętości wynoszącej 50 µl, aby uniknąć wykonywania

więcej niż 3 cykli zamrażania/rozmrażania.

Instrukcja użytkowania zestawu VetMAX™ BVDV 4ALL Kit

Kontrole ekstrakcji i amplifikacji

Zestaw VetMAX BVDV 4ALL Kit zawiera 2 kontrole umożliwiające walidację procesu ekstrakcji i amplifikacji wirusowego RNA.

4c-EPC BVDV 4ALL: Kontrola dodatnia BVDV

Ekstrakcję lub lizę 4c-EPC BVDV 4ALL i próbki należy wykonać w tym samym czasie, jak opisano w poniższej tabeli.

Metoda ekstrakcji lub lizy

Objętość 4c-EPC BVDV 4ALL

Objętość roztworu elucyjnego

Kolumny krzemionkowe lub kulki magnetyczne

50 µl

50–80 µl

Szybki proces lizy

50 µl

RNA wyekstrahowane z 4c-EPC BVDV 4ALL należy przechowywać w temperaturze poniżej −16°C. W razie konieczności

przechowywać w mniejszych podwielokrotnościach, aby uniknąć wykonywania więcej niż 3 cykli zamrażania/rozmrażania.

Dodatni wynik w określonym zakresie Ct wykorzystuje się do zwalidowania procesu ekstrakcji i amplifikacji BVDV w reakcji

RT-PCR.

5-IPC BVDV 4ALL: egzogenna wewnętrzna kontrola dodatnia (dotyczy tylko surowicy)

Próbki surowicy wymagają użycia egzogennego źródła IPC; składnik ten dodaje się do roztworu lizującego używanego do

ekstrakcji RNA z próbek surowicy oraz do przygotowania próbki będącej dodatnią kontrolą dla BVDV i ujemną kontrolą procesu

ekstrakcji (NCS). Cel IPC jest już obecny w próbkach komórkowych (krew i wycinki z małżowiny usznej), więc dodawanie 5-IPC

BVDV 4ALL do takich próbek nie jest konieczne.

W przypadku serii ekstrakcji obejmujących wyłącznie próbki surowicy należy dodać 5 µl 5-IPC BVDV 4ALL do buforu lizującego

w trakcie procesu ekstrakcji RNA z próbek, kontroli dodatniej BVDV i NCS. Alternatywnie w przypadku wykorzystania wyłącznie

do kontroli procesu amplifikacji należy dodać 5 µl 5-IPC BVDV 4ALL do 50 µl wyekstrahowanego RNA.

W przypadku serii ekstrakcji, która nie obejmuje próbek surowicy, należy przygotować roztwór lizujący bez 5-IPC BVDV 4ALL dla

próbek materiału komórkowego, kontroli dodatniej BVDV oraz NCS.

W przypadku serii ekstrakcji, które obejmują próbki surowicy i próbki komórkowe:

• Dodać 5 µl 5-IPC BVDV 4ALL do buforu lizującego dla próbek surowicy, kontroli dodatniej BVDV i NCS.

• Przygotować roztwór lizujący bez 5-IPC BVDV 4ALL w przypadku próbek komórkowych w seriach ekstrakcji.

Jako kryteria walidacji próbek lub kontroli należy przyjąć wartości Ct dla IPC podane w części „Walidacja” i „Interpretacja

wyników”.

Zalecamy uwzględnienie dwóch kontroli ujemnych, aby potwierdzić poprawność analizy:

NCS: kontrola ujemna procesu ekstrakcji

Składa się z odczynników używanych do ekstrakcji bez dodatku próbki (objętość próbki można zastąpić buforem stosowanym w

procesie jej przygotowania albo wodą wolną od DNaz/RNaz) i jest przygotowywana tak, jak próbki.

Pozwala zweryfikować brak zanieczyszczeń w trakcie ekstrakcji i reakcji RT-PCR. Jako kryteria walidacji braku zanieczyszczeń

należy przyjąć wartości Ct dla NCS podane w części „Walidacja”.

NC: kontrola ujemna procesu amplifikacji

Jest to mieszanina amplifikacyjna naniesiona na płytkę w trakcie przygotowywania reakcji RT-PCR, z 5 µl wody wolnej od

DNaz/RNaz dodanymi w celu skorygowania objętości reakcji do 25 µl lub 15 µl, w zależności od typu amplifikacji (co z kolei

zależy od metody ekstrakcji wirusowego RNA). W przypadku wszystkich rodzajów materiału biologicznego kontrola ta

potwierdza brak zanieczyszczenia w trakcie przygotowywania reakcji RT-PCR, jeśli jest negatywna dla wszystkich celów reakcji

(BVDV oraz IPC).

Materiały potrzebne, niedostarczane

O ile nie wskazano inaczej, wszystkie materiały są dostępne na stronie thermofisher.com.

• Regulowane mikropipety (w zakresie od 1 µl do 1000 µl) z końcówkami filtrującymi wolnymi od DNaz/RNaz.

• Woda wolna od DNaz/RNaz.

• Bufor 1X TE.

• Bufor 1X PBS.

• Termocykler RT wyposażony w funkcję wykrywania następujących fluoroforów: FAM™ (maks. emisja: λ515 nm), VIC™

(maks. emisja: λ554 nm) i barwnik pasywny ROX™.

• Materiały eksploatacyjne o jakości optycznej zgodne z używanym termocyklerem:

- płytki PCR z 96 studzienkami, paski do PCR (8 lub 12 studzienek), mikroprobówki lub kapilary,

- filmy albo zgodne zatyczki.

Procedura analizy

Objętość mieszany reakcyjnej w reakcji RT-PCR wynosi 25 µl lub 15 µl, w zależności od typu amplifikacji (co z kolei zależy od

zastosowanej metody ekstrakcji wirusowego RNA):

Rekonstytucja mieszaniny reakcyjnej

Zastosowanie standardowe (ekstrakcja RNA

w kolumnach lub z użyciem kulek

magnetycznych)

Zastosowanie procesu szybkiej lizy

do wycinków z małżowiny usznej

(ekstrakcja RNA poprzez szybką lizę)

3-Mix BVDV 4ALL

20 μl

10 μl

RNA wyekstrahowane z próbek

5 µl

Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej

25 μl

15 μl

Instrukcja użytkowania zestawu VetMAX™ BVDV 4ALL Kit

Ekstrakcja wirusowego RNA

Do przeprowadzenia analizy RT-PCR należy wyizolować RNA z próbek.

Przed pierwszym użyciem tego zestawu należy przygotować próbkę z dodatnią kontrolą dla BVDV, przeprowadzając ekstrakcję

4c-EPC BVDV 4ALL z użyciem tej samej metody, co przy badanych próbkach. Próbka z dodatnią kontrolą BVDV może zostać

użyta w następnych analizach RT-PCR z badanymi próbkami, które zostały wyekstrahowane przy użyciu tej samej metody.

W przypadku próbek surowicy należy dodać 5 µl 5-IPC BVDV 4ALL do buforu lizującego użytego do ekstrakcji RNA z próbek,

kontroli dodatniej BVDV i NCS.

WAŻNE: Informacje dotyczące metod ekstrakcji zgodnych z zestawem VetMAX™ BVDV 4ALL Kit i dla niego zwalidowanych oraz

informacje o zestawie VetMAX™ Ear Notch Fast Lysis Kit (nr kat. FLK) można uzyskać, kontaktując się z działem pomocy

technicznej.

Przygotowanie reakcji real-time RT-PCR

1. Należy przygotować plan analizy dotyczący rozmieszczenia mieszanin i próbek. Kontrolę dodatnią BVDV należy

przechowywać, o ile to możliwe, z dala od pozostałych próbek.

2. Rozmrozić 3-Mix BVDV 4ALL w temperaturze +2°C do +8°C, w lodzie albo na chłodzonym statywie.

3. Wymieszać 3-Mix BVDV 4ALL, delikatnie wstrząsając, a następnie krótko odwirować.

4. W zależności od zastosowania, do każdej studzienki na płytce PCR, paska do PCR albo do każdej kapilary należy dodać

20 μl lub 10 μl 3-Mix BVDV 4ALL.

5. Dodać RNA z próbek i kontroli do mieszaniny do reakcji real-time RT-PCR, postępując zgodnie z opracowanym wcześniej

planem analizy:

Typ analizy

Składnik

Objętość próbki

Próbka do analizy

RNA wyekstrahowane z próbki

5 µl

Kontrola dodatnia BVDV

RNA wyekstrahowane z 4c-EPC BVDV 4ALL

5 µl

Kontrola ujemna procesu ekstrakcji (NCS)

Próbka z kontrolą ujemną procesu ekstrakcji

5 µl

Kontrola ujemna procesu amplifikacji (NC)

Woda wolna od DNaz/RNaz

5 µl

6. Przykryć płytkę PCR, paski do PCR lub kapilary samoprzylepną pokrywką albo zgodnymi zatyczkami.

Amplifikacja techniką real-time RT-PCR

1. Należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta, aby ustawić cykl reakcji RT-PCR według poniższych parametrów:

• objętość mieszaniny reakcyjnej: 15 µl (proces szybkiej lizy) lub 25 µl (standardowe zastosowanie),

• pasywny barwnik referencyjny ROX™: zawarty w 3-Mix BVDV 4ALL.

2. Należy ustawić i przypisać barwniki reporterowe sondy TaqMan® i wygaszacze dla każdej studzienki stosowanej w

analizie:

Cel

Reporter

Wygaszacz

BVDV

barwnik FAM

wygaszacz niefluorescencyjny (NFQ)

IPC

barwnik VIC

barwnik TAMRA (1)

Pasywny barwnik referencyjny: barwnik ROX™

(2)

(1) Barwnik TAMRA™ należy ustawić do analizy RT-PCR, jeśli termocykler jest wyposażony w funkcję jego wykrywania. W przypadku innych

termocyklerów brak funkcji wykrywania tego fluoroforu nie wpływa na dokładność odczytu.

(2) Pasywny barwnik referencyjny ROX™ należy ustawić, jeśli termocykler nie robi tego automatycznie.

3. Należy utworzyć następujący program reakcji RT-PCR dla analizy:

Program 1

Powtórzenia etapów

Temperatura

Czas trwania

Etap 1

1 x

45°C

10 minut

Etap 2

1 x

95°C

10 minut

Etap 3 45 x

95°C

15 sekund

60°C

(1)

1 minuta

(1) Zarejestrować dane dotyczące fluorescencji podczas 1-minutowego etapu w temp. 60°C.

4. Umieścić płytkę PCR, paski do PCR lub kapilary w termocyklerze i uruchomić cykl reakcji real-time RT-PCR.

Analiza wyników

Analiza danych surowych

W celu wykonania analizy danych surowych należy zapoznać się z zaleceniami producenta termocyklera.

1. Wartości cyklu granicznego należy ustawić osobno dla każdego celu reakcji real-time RT-PCR.

2. Dla każdego detektora wyniki należy interpretować na podstawie uzyskanych wartości Ct dla próbki, jak opisano poniżej.

thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion

thermofisher.com

27 grudnia 2018

Walidacja

Aby zwalidować cykl reakcji RT-PCR, należy posłużyć się wartościami Ct QC podanymi w certyfikacie analizy serii produkcyjnej, która została

użyta do przeprowadzenia testu. Oznaczenie uznaje się za zwalidowane, gdy spełnione zostaną następujące kryteria:

Reakcja kontrolna Cel BVDV (barwnik FAM™)

Cel IPC (barwnik VIC

™

)

Walidacja

Bez

5-IPC BVDV 4ALL

(1)

Z użyciem

5-IPC BVDV 4ALL

(2)

Kontrola dodatnia BVDV

= C

t QC

BVDV z “4c-EPC

BVDV 4ALL” ±3C

t(3)

Ct < 45 lub Ct > 45(4)

= C

t QC

IPC z “5-IPC BVDV

4ALL” ±3C

t(3)

Zwalidowano RT-PCR

NCS Ct > 45 Ct > 45

= C

t QC

IPC z “5-IPC BVDV

4ALL” ±3Ct(3)

Zwalidowano proces

ekstrakcji

NC Ct > 45 Ct > 45 Ct > 45

Zwalidowano odczynniki

do reakcji PCR

(1) Dotyczy serii ekstrakcji, która nie obejmuje próbek surowicy.

(2) Dotyczy serii ekstrakcji, która obejmuje wyłącznie próbki surowicy lub kombinację próbek surowicy i próbek komórkowych.

(3) Należy posłużyć się wartościami podanymi dla zastosowanej metody ekstrakcji, opisanymi w rozdziale 2.1 „EPC” certyfikatu analizy.

(4) Wartość IPC kontroli dodatniej BVDV nie służy do walidacji testu w przypadku badania próbek komórkowych.

(5) Należy posłużyć się wartościami podanymi w rozdziale 2.2 „IPC” certyfikatu analizy. Interpretacja wyników

Interpretacja wyników

Wyniki uzyskane dla każdej zbadanej próbki należy interpretować w sposób przedstawiony w poniższych tabelach.

Cel BVDV (barwnik FAM™)

Cel IPC (barwnik VIC™)

Interpretacja

Ct < 45

Ct < 45 lub Ct > 45

Wykryto BVDV

> 45

< 45

Nie wykryto BVDV

> 45

Błędne wyniki (1)

(1) Wynik jest błędny z powodu niezgodności wyniku IPC.

Postępowanie z próbkami generującymi błędne wyniki

1. Rozcieńczyć RNA w stosunku 1:10 w buforze 1X TE.

2. Wykonać analizę RT-PCR z wykorzystaniem 5 µl rozcieńczonej próbki.

3. Jeśli wynik badania rozcieńczonej próbki RNA jest dodatni albo ujemny w kierunku BVDV przy zgodnym wyniku dla IPC,

uzyskany wynik analizy należy uznać za poprawny.

4. Jeśli wynik badania rozcieńczonej próbki RNA jest ujemny w kierunku BVDV przy niezgodnym wyniku dla IPC, uzyskany

wynik analizy należy uznać za błędny. W takim przypadku należy zastosować następujący schemat postępowania:

a. Badanie wycinków z małżowiny usznej: należy powtórzyć proces ekstrakcji RNA i wykonać analizę RT-PCR z

wykorzystaniem nowego wycinka z małżowiny usznej lub z wykorzystaniem innej próbki pochodzącej od tego samego

zwierzęcia, jeśli pozwalają na to przepisy prawa krajowego albo rozporządzenia lokalne.

b. Badanie próbki innej niż wycinki z małżowiny usznej: należy powtórzyć proces ekstrakcji RNA, używając tej samej próbki

rozcieńczonej w stosunku 1:10 w buforze 1X PBS i wykonać analizę RT-PCR. Jeśli wynik pozostaje błędny, należy

powtórzyć proces ekstrakcji RNA i wykonać analizę RT-PCR z wykorzystaniem nowej próbki.

Dokumentacja i pomoc

Obsługa klienta i pomoc techniczna

Pomoc techniczna: odwiedź stronę thermofisher.com/askaquestion

Na stronie thermofisher.com/support znajdują się informacje

o najnowszych usługach i oferowanym wsparciu, w tym:

• numery telefonów kontaktowych na całym świecie

• pomoc w zakresie zamówień i korzystania z witryny

internetowej

• podręczniki użytkownika, poradniki i protokoły

• certyfikaty analizy

• karty charakterystyki substancji niebezpiecznej (SDS,

zwane również MSDS).

WAŻNE: W przypadku kart charakterystyki substancji dotyczących

odczynników i substancji chemicznych innych producentów należy

skontaktować się z odpowiednim wytwórcą.

Ograniczona gwarancja na produkt

Firma Life Technologies Corporation i/lub jej podmioty zależne

udzielają gwarancji na produkty, jak opisano w dokumencie Life

Technologies' General Terms and Conditions of Sale (Ogólne

Warunki Handlowe), dostępnym w witrynie internetowej firmy Life

Technologies pod adresem www.thermofisher.com/us/en/home/

global/terms-and-conditions.html. W razie pytań należy się

skontaktować z firmą Life Technologies pod adresem

thermofisher.com/support.

Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Écureuils | Parc

Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu, France

Tłumaczenie z publikacji wersji angielskiej Pub. No. MAN0008959 Rev. B.0.

Informacje podane w niniejszej instrukcji mogą ulec zmianie bez powiadomienia.

ZRZECZENIE SIĘ ODPOWIEDZIALNOŚCI: W ZAKRESIE DOZWOLONYM PRZEZ PRAWO

FIRMA LIFE TECHNOLOGIES I/LUB JEJ PODMIOTY STOWARZYSZONE NIE PONOSZĄ

ODPOWIEDZIALNOŚCI ZA SZKODY SZCZEGÓLNE, PRZYPADKOWE, POŚREDNIE,

SANKCYJNE, WIELOKROTNE LUB WYNIKOWE ZWIĄZANE Z NINIEJSZYM DOKUMENTEM

LUB WYNIKAJĄCE Z NIEGO, W TYM ZWIĄZANE Z JEGO ZASTOSOWANIEM.

Historia zmian Poz. Nr MAN0008959 (wersja angielska)

Wersja

Data

Opis

B.0 20 czerwca

2017

Zaktualizowane do obecnego szablonu dokumentu

wraz z powiązanymi aktualizacjami gwarancji,

znaków towarowych I logo.

A.0

kwiecień 2014

Dodano instrukcję użytkowania 5 - IPC BVDV 4ALL.

1.0

październik

2013

Nowy dokument.

Licencja na ograniczone zastosowanie nr 460: Diagnostyka weterynaryjna PCR.

Informacja dla nabywcy: Wyłącznie do celów związanych z usługami diagnostyki

weterynaryjnej łącznie z odpłatnym zgłaszaniem takich usług oraz do celów badawczych.

Zastosowanie do celów związanych z diagnostyką u ludzi wymaga oddzielnej licencji firmy

Roche.

towarowe są własnością firmy Thermo Fisher Scientific i jej podmiotów zależnych, chyba

że określono inaczej. TaqMan jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Roche,

używanym na podstawie zezwolenia i licencji.

Thermo Fisher Scientific VetMAX BVDV 4ALL Kit Instrukcja obsługi

Marka: Thermo Fisher Scientific

Model: VetMAX BVDV 4ALL Kit

Typ: Instrukcja obsługi

Pobierz PDF

raport

Thermo Fisher Scientific VetMAX BVDV 4ALL Kit Instrukcja obsługi

Thermo Fisher Scientific VetMAX BVDV 4ALL Kit Instrukcja obsługi

Powiązane artykuły

Inne dokumenty